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動(dòng)態(tài)濁度法的建立及測定角膜真菌感染標本的初步研究
作者：劉宏偉，王香蘭，彭淑玲，周 毅
【摘要】 目的 建立動(dòng)態(tài)濁度法，研究角膜真菌感染的檢測。方法 分別測定葡聚糖標準品、內毒素標準品、真菌標準株(煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌)及細菌標準株(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌)，測定19例臨床標本。
結果 葡聚糖的濃度時(shí)間曲線(xiàn)為雙曲線(xiàn)，時(shí)間反應曲線(xiàn)顯示反應速率較低。內毒素的濃度時(shí)間曲線(xiàn)為直線(xiàn)，時(shí)間反應曲線(xiàn)顯示反應速率較高。三種真菌的濃度時(shí)間曲線(xiàn)和時(shí)間反應曲線(xiàn)與葡聚糖的相似，革蘭陰性菌（綠膿桿菌）的濃度時(shí)間曲線(xiàn)和時(shí)間反應曲線(xiàn)與內毒素的相似，革蘭陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）沒(méi)有反應。臨床19例標本，根據其濃度時(shí)間曲線(xiàn)和時(shí)間反應曲線(xiàn)的形態(tài)，11例確診為真菌感染，8例為革蘭陰性細菌曲線(xiàn)，為真菌和細菌的混合感染。
結論 動(dòng)態(tài)濁度法可用于角膜真菌感染的檢測，但對細菌-真菌混合感染不能確診。
【Abstract】 Objective To establish the turbidimetric kinetic assay and study the measurement of fungus infection in corneal specimen.Methods Glucan， endotoxin， fungus(Aspergillus fumigatus，Fusariun moniliforme and Fusariun solani) and bactiria(Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureaus) were measured. 19 clinic specimens were also measured.Results The concentration-time curve of glucan was hyperbola and its time-reaction curve had low reaction rate. The concentration-time curve of endotoxin was beeline and its time-reaction curve had high reaction rate. The concentration-time curve and time-reaction curve of 3 fungi were same as that of glucan. The concentration-time curve and time-reaction curve of G- bacterium(Pseudomonas aeruginosa) were as same as that of endotoxin. The G+ bacterium(Staphylococcus aureaus) had no reaction. According the concentration-time curve and time-reaction curve， 11 specimens were diagnosed fungi and 8 specimens were co-infection of fungi and bacteria.Conclusion Fungi infection in cornea could be diagnosed by turbidimetric kinetic method. Co-infection of fungi and bacteria could not be diagnosed by this method.
【關(guān)鍵詞】 動(dòng)態(tài)濁度法；真菌；角膜；葡聚糖
【Key words】 turbidimetric kinetic method；fungus；cornea；glucan
角膜真菌感染的診斷較難，如不能及時(shí)治療，對患者造成損害，因此快速診斷非常必要。真菌的診斷一般采用鏡檢和培養的方法，鏡檢較快，但漏檢率較高，真菌培養的方法，檢出率較高，但時(shí)間較長(cháng)。我們使用鱟試劑與真菌的葡聚糖反應的原理，建立動(dòng)態(tài)濁度法并對角膜標本進(jìn)行真菌測定。
1 材料與方法
1.1 試劑 葡聚糖標準品(031222，規格：300μg/ml)，鱟試劑（批號040532，靈敏度：0.25Eu/ml）購自廈門(mén)鱟試劑廠(chǎng)，內毒素標準品（批號2002-7）和檢測用水(批號2003-3)購自中國藥品生物制品檢定所。
1.2 儀器 細菌內毒素測定儀、振蕩器，超聲波處理器、離心機。
1.3 葡聚糖和內毒素的濃度-時(shí)間曲線(xiàn)
1.3.1 葡聚糖 將其倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和 0.20μg/ml，取其200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，放入細菌內毒素測定儀測定，測定溫度為(37±1)℃。
1.3.2 內毒素 將其10倍稀釋為50、5、0.5、0.05和0.005EU/ml，按上述方法測定。
1.4 細菌、真菌標準株的測定 細菌包括革蘭陰性菌(綠膿桿菌)和陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)，真菌包括煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌。在培養基上取少量菌落，加入1ml檢測用水，超聲波處理30min，2000cpm，10min，取上清。用檢測用水將其按10倍稀釋?zhuān)謩e取200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，細菌內毒素測定儀測定。
1.5 標本的處理 角膜標本來(lái)自北京普仁醫院眼科，為臨床確診真菌性角膜炎后，進(jìn)行角膜移植，將角膜標本用檢測用水沖洗后，在潔凈臺中將其剪碎，加入1ml檢測用水超聲波處理30min，2000cpm，10min，取上清備用。
1.6 標本的測定和結果的確定 共檢測臨床診斷真菌的感染的角膜標本19例，標本處理后，用檢測用水將其按10倍稀釋8個(gè)稀釋度，分別取200μl加入100μl鱟試劑，振蕩30s，放入細菌內毒素測定儀測定。根據標本的濃度-時(shí)間曲線(xiàn)、時(shí)間反應曲線(xiàn)和時(shí)間速率曲線(xiàn)確定。
1.7 細菌內毒素測定儀的檢測指標 內毒素或葡聚糖與鱟試劑中的B、C或G因子反應，形成凝膠，記錄不同濃度的內毒素或葡聚糖在反應過(guò)程中不同時(shí)間的光密度值，確定OD值達到0.02的反應時(shí)間為測定反應時(shí)間，以反應時(shí)間為縱坐標，以藥物濃度為橫坐標，做圖，成為濃度時(shí)間曲線(xiàn)。時(shí)間反應曲線(xiàn)為某一濃度的內毒素或葡聚糖在不同時(shí)間的OD值，以時(shí)間為橫坐標，以樣品的OD值為縱坐標，做圖。時(shí)間速率曲線(xiàn)為某一濃度的內毒素或葡聚糖在不同時(shí)間的反應速率，以時(shí)間為橫坐標，以樣品的反應速率為縱坐標，做圖。
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